Enfermedad de von Willebrand tipo 2M-C: un diagnóstico fugitivo. Acerca de un caso.

Type 2M-C von Willebrand disease: a fugitive diagnosis. About a case.

Woods AI¹, Alberto MF¹, Castera S¹, Berger CS^2,3, Lopez MS^2,3, Martinuzzo ME^2,3, Guerrero O¹, Blanco AN¹, Sánchez-Luceros A^1,4

¹Departamento de Hemostasia y Trombosis, Instituto de Investigaciones Hematológicas, Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires, CABA, Argentina.

²Laboratorio Central, Sección Hemostasia, Hospital Italiano de Buenos Aires, CABA, Argentina.

³Departamento de Bioquímica Aplicada, Instituto Universitario del Hospital Italiano de Buenos Aires, CABA, Argentina

⁴Laboratorio de Hemostasia y Trombosis, Instituto de Medicina Experimental-CONICET, Academia Nacional de Medicina de Buenos Aires, CABA, Argentina

ORCID

Adriana Inés Woods PhD https://orcid.org/0000-0002-4077-1796

María Fabiana Alberto PhD https://orcid.org/0000-0001-7048-2031

Santiago Castera MS https://orcid.org/0000-0003-2751-6392

Claudio Sebastián Berger https://orcid.org/0009-0004-0460-0780

Marina Sol López MS https://orcid.org/0009-0002-4080-8250

Marta Elba Martinuzzo PhD https://orcid.org/0000-0002-1281-7144

Alicia Noemí Blanco PhD https://orcid.org/0000-0002-6933-1057

Analía Sánchez-Luceros MD, PhD https://orcid.org/0000-0002-2971-9217

Mail de contacto: adrianawoods@gmail.com

Palabras claves: biología molecular,

factor von Willebrand,

enfermedad de von Willebrand.

Keywords: von Willebrand factor,

von Willebrand disease,

diagnostic methods; molecular biology.

Resumen

La enfermedad de von Willebrand tipo 2M-C (VWD2M-C) se caracteriza por disminución de VWF:CB pero niveles normales de VWF:Ag y VWF:RCo. Este defecto es causado por variantes genéticas causantes de enfermedad (VGCE) en el dominio A3 del VWF que afectan la unión del VWF al colágeno.

Describimos los hallazgos fenotípicos y genotípicos en un hombre de 60 años con resultados de laboratorio sugestivos de VWD2, con índice de sangrado de 5, según el ISTH-BAT, sin antecedentes familiares de sangrado.

Métodos. Se realizó una evaluación hemostática que incluyó tiempo de cierre (TC) de PFA-200, FVIII, VWF:Ag, VWF:RCo, VWF:GPIbR, VWF:CB1,VWF:CB3, multímeros del VWF, estudios funcionales plaquetarios (lumi-agregometría, captación de mepacrina) y estudios genéticos de los dominios VWF-A1, A2 y A3.

Resultados. Primer estudio: el paciente presentó el PFA-200CT extremadamente prolongado con el cartucho Col/Epi y ligeramente prolongado con el cartucho Col/ADP con una relación VWF:GPIbR/VWF:Ag anormal. Segundo estudio: se observaron VWF:Ag, VWF:RCo y multímeros del VWF normales, pero niveles bajos de VWF:CB1 y VWF:CB3. Por lumi-agregometría se observaron agregación con ristocetina (RIPA, concentraciones estándar y bajas), ácido araquidónico y colágeno normales, ausencia de la segunda onda y liberación de ATP bajo estimulación con ADP y adrenalina, con contenido normal de gránulos densos plaquetarios. Por estudios genotípicos, se identificó la VGCE c.5191T>A → p.Ser1731Thr en el exón 30 (dominio A3) en heterocigosis. El paciente se diagnosticó como VWD2M-C.

Conclusión. En nuestro paciente, p.Ser1731Thr pareció ser responsable del PFA-200CT anormal. Dado que VWF:RCo y VWF:GPIbR miden la interacción VWF-plaquetas, y que VWF:CB mide la interacción VWF-colágeno, es de suma importancia realizar ambos ensayos para evitar la posible falta de diagnóstico de VWD2M-C en estos pacientes.

Summary

The type 2M-C von Willebrand disease (VWD2M-C) is characterized by a decreased VWF:CB but normal VWF and VWF:RCo levels. This defect is caused by disease-causing variants (DCVs) at the A3 domain of VWF affecting VWF-collagen binding.

We describe the phenotypic and genotypic findings in a 60-year-old male with laboratory results suggestive of VWD2 presenting an ISTH-BAT of 5, without family bleeding history.

Methods. Hemostatic assessment was performed including PFA-200 closure time (CT), FVIII, VWF:Ag, VWF:RCo, VWF:GPIbR, VWF:CB1,VWF:CB3, VWF multimers, platelet functional studies (lumi-aggregometry, mepacrine uptake), and genetic studies of VWF-A1, A2 and A3-domains.

Results. First study: the patient presented PFA-200CT extremely prolonged with Col/Epi cartridge and slightly prolonged Col/ADP one, and abnormal VWF:GPIbR/VWF:Ag ratio. Second study: the patient showed normal VWF:Ag, VWF:RCo and VWF multimers, but low VWF:CB1 and VWF:CB3 levels.

The lumi-aggregometric studies showed normal ristocetin (RIPA, standard and low concentrations), arachidonic acid and collagen induced platelet aggregation; absence of the second wave and ATP release under ADP and epinephrine stimulation, and normal content of platelets’ dense granules.

By genetic studies, the missense change c.5191T>A → p.Ser1731Thr in exon 30 (A3-domain) was identified in heterozygous state. The patient was diagnosed as VWD2M-C.

Conclusion. In our patient, p.Ser1731Thr seemed to be responsible for the abnormal PFA-200CT. Since the VWF:RCo and VWF:GPIbR measure the VWF-platelet interaction, while the VWF:CB, the VWF-collagen interaction, it is of utmost importance to perform both assays types to overcome the potential lack of VWD2M-C patients' diagnosis.

Introducción

La enfermedad de von Willebrand tipo 2M (VWD2M) es causada por variantes genéticas causales de enfermedad (VGCE) con modo de herencia autosómica y dominante, localizadas en el dominio A1 o A3 del factor von Willebrand (VWF), sin pérdida de los multímeros de alto peso molecular (HMWM) del mismo. Las VGCEs localizadas en el dominio A1 conducen a un defecto en la unión del VWF a la glicoproteína Ibα (GPIbα) plaquetaria, con disminución de los cocientes de los ensayos de actividad que miden esta interacción: VWF:RCo/VWF:Ag, VWF:GPIbR/VWF:Ag y VWF:GPIbM/VWF:Ag. Este subtipo se ha denominado VWD2M-P.

Por otro lado, las VGCE localizadas en el dominio A3 afectan la capacidad de unión del VWF al colágeno, cuyo efecto es la disminución de la unión del VWF a los colágenos tipos I y III (VWF:CB1 y VWF:CB3) subendoteliales, sin que se altere la capacidad de unión del VWF a la GPIbα plaquetaria. Por lo tanto, los niveles de VWF y VWF:RCo son normales. Este subtipo se denomina actualmente VWD2M-C.

Hay pocos trabajos descriptos que reporten este subtipo. El primer reporte del mismo⁽¹⁾ describe la mutación p.S1731T en el exón 30, en heterocigosis en dos pacientes (madre e hija) con epistaxis, equimosis y menorragia. Posteriormente se han publicado más hallazgos similares, asociados a la presencia de VGCEs en el dominio A3^(2-6).

Nuestro objetivo es describir el caso de un varón de 60 años con diagnóstico previo de síndrome metabólico que fue remitido desde otro centro con resultados de laboratorio sugestivos de VWD2, que presentaba ISTH-BAT (International Society in Thrombosis and Haemostasis-Bleeding Assessment Tool) de 5, sin antecedentes familiares de sangrado.

Material y métodos

Los métodos utilizados en este paciente fueron:

· Estudios fenotípicos para evaluación hemostática que incluyen:

TTPA, FVIII (método de una etapa), VWF:Ag (ELISA e inmunoturbidimetría), VWF:RCo (agregometría), VWF:GPIbR (inmunoturbidimetría), VWF:CB (ELISA desarrollado) utilizando colágenos tipo 1 (VWF:CB1) y tipo 3 (VWF:CB3), perfil multimérico del VWF (electroforesis en gel de agarosa-SDS 1% y 1,7%), recuento de plaquetas en sangre entera (RP). Se calcularon los cocientes VWF:RCo/VWF:Ag, VWF:CB1/VWF:Ag, VWF:CB3/VWF:Ag y VWF:GPIbR/VWF:Ag, considerando normal un cociente >0,7, según las nuevas guías de diagnóstico publicadas recientemente⁽⁷⁾.

· Estudios funcionales plaquetarios:

Tiempo de oclusión (TC) de PFA-200, lumi-agregometría, captación de mepacrina por citometría de flujo, RIPA a concentración estándar (1,2 mg/mL) y baja (≤0,7 mg/mL) de ristocetina.

El paciente fue estudiado en tres ocasiones para confirmar los hallazgos anormales.

· Estudios genotípicos:

El ADN genómico se extrajo de leucocitos de sangre periférica. Los exones 28 al 31 del gen VWF (dominios A1, A2 y A3) se amplificaron mediante tecnología de PCR previamente descripta⁽⁸⁾y se secuenciaron utilizando metodología de Sanger. Cuando se identifica una VGCE, la cadena complementaria del ADN se secuencia para confirmar su presencia.

Resultados

En un primer estudio realizado en el Hospital Italiano de Buenos Aires se detectó el PFA-200CT extremadamente prolongado con el cartucho Col/Epi y ligeramente prolongado con el cartucho Col/ADP, y una relación VWF:GPIbR/VWF:Ag anormal.

En un segundo estudio realizado en el Departamento de Hemostasia y Trombosis del Instituto de Investigaciones Hematológicas de la Academia Nacional de Medicina se observaron: RIPA normal a concentración estándar y ausente a concentración baja, agregación normal con ácido araquidónico y colágeno; ausencia de la segunda onda y de liberación de ATP bajo estimulación con ADP y adrenalina. El contenido de gránulos densos de las plaquetas se halló normal, como se observó mediante la captación de mepacrina. Los resultados se muestran en la figura 1.

Se realizaron VWF:Ag y VWF:RCo, VWF:CB1 y VWF:CB3 y perfil multimérico del VWF. El paciente mostró niveles normales de VWF:Ag, VWF:RCo, patrón multimérico normal, pero bajos niveles de VWF:CB1 y VWF:CB3, con cocientes VWF:CB/VWF:Ag discordantes (<0,7). Se decidió realizar estudios de biología molecular en el exón 28 del gen VWF, no observándose la presencia de VGCEs en dicho exón.

Figura 1. Agregación plaquetaria del paciente con diferentes agonistas

En un tercer estudio se repitieron las determinaciones VWF:Ag, VWF:RCo, que nuevamente se hallaron normales, y VWF:CB1 y VWF:CB3, confirmándose disminuidos. Frente a estos resultados, ante la sospecha de tratarse de VWD2M-C, se decidió realizar la búsqueda de VGCEs en los exones del 29 al 31. Los resultados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Resultados fenotípicos del paciente

Estudios de laboratorio (rango normal)	Hospital Italiano	Dto de Hemostasia y Trombosis, ANM
Estudios de laboratorio (rango normal)	resultados	1° resultados	2° resultados
RP (150-450x10⁹/L)	-	320	311
TC Col/Epi (73-175 seg)	>300	-	-
TC Col/ADP (50-112 seg)	150	-	-
TS (1,5-4,5 min)	-	4,0	-
FVIII (50-150 UI/dL)	117	90	110
VWF:Ag (50-150 UI/dL)	86	69	70
VWF:RCo (50-150 UI/dL)	-	55	60
VWF:RCo/VWF:Ag (≥0,7)	-	0,8	0,9
VWF:GPIbR (50-150 UI/dL)	41	-	-
VWF:GPIbR/VWF:Ag (≥0,7)	0,5	-	-
VWF:CB1 (60-130 UI/dL)	-	15	18
VWF:CB1/VWF:Ag (≥0,7)	-	0,22	0,28
VWF:CB3 (60-160 UI/dL)	-	35	42
VWF:CB3/VWF:Ag (≥0,7)	-	0,5	0,6
RIPA 1,2 mg/mL	-	Normal	Normal
RIPA 0,7 mg/mL	-	Ausente	Ausente
VWF perfil multimérico	-	Normal	-

Mediante los estudios de biología molecular se identificó la VGCE c.5191T>A que codifica para p.Ser1731Thr en el exón 30 en heterocigosis.

Los estudios restantes del paciente no revelaron anomalías.

Conclusión

En nuestro paciente con sintomatología hemorrágica leve-moderada, el hallazgo de los TC prolongados con el PFA-200, VWF:Ag, VWF:RCo normales y VWF:GPlbR ligeramente disminuido pero VWF:CB francamente anormal con ambos colágenos (tipos I y III) despertó la sospecha de VWD2M-C y llevó a la búsqueda de variantes genotípicas en el dominio A3 del VWF y el hallazgo de la mutación p.Ser1731Thr. Esta VGCE está descripta asociada con VWD2M-C en personas con sangrado leve-moderado e inclusive asintomáticas. En nuestro paciente, parecería ser responsable, además, del PFA-200CT anormal, y con ambos cartuchos. Este primer hallazgo suscitó la búsqueda de alteraciones en el dominio A3, con los resultados descriptos.

Sin embargo, no se puede descartar que la alteración de la función plaquetaria con ADP/adrenalina contribuya a la anormalidad del PFA-200CT, particularmente al TC más prolongada con cartucho PFA-COL/Epi que es un patrón más frecuente en las trombocitopatías y en fenotipos con mayor sangrado^(9,10).

Dado que el VWF:RCo y GPIbR miden la interacción VWF-plaquetas, y el VWF:CB la interacción VWF-colágeno, es de suma importancia realizar ambos ensayos para evitar la posible falta de diagnóstico de VWW2M-C en pacientes con VWF:Ag ensayos de unión VWF-plaquetas normales.

Bibliografía

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