Determinación de la estabilidad de linfocitos T con variables de tiempo y temperatura a través de citometría de flujo en el laboratorio Synlab 2021

 

Determination of the stability of T-lymphocytes with time and temperature variables through flow cytometry in the Synlab 2021 laboratory

 

Hurtado LJ1, Jaramillo P2, Vanegas JM3, Rojas M4, Tamayo G1

 

1. Centro Especializado de Patología Oncohematológica, Laboratorio Clínico Synlab SAS, Medellín-Colombia

2. Universidad de Antioquia, Medellín-Colombia

3. Universidad Pontificia Bolivariana, Medellín-Colombia

4. Instituto de Investigaciones Médicas, Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medellín-Colombia

 

johana.hurtado@udea.edu.co

 

Palabras clave:          viabilidad,

                                    citometría,

                                    linfocitos T,

                                    temperatura.

Key words:    viability,

                        cytometry,

                        T lymphocytes,

                        temperature.

 

Resumen

Introducción: la cuantificación de subconjuntos de linfocitos T se realiza de manera rutinaria en pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (VIH) por citometría de flujo, con el fin de estadificar la infección y la respuesta a la terapia antirretroviral. Aunque algunas casas comerciales sugieren procesar las muestras en un período de 48 horas a 20-25 °C, no hay consenso acerca de las condiciones de tiempo y temperatura en las cuales no hay afectación de los linfocitos T. Materiales y métodos: se evaluaron 50 muestras de sangre total con anticoagulante EDTA, provenientes del área metropolitana de Medellín. Cada una fue expuesta bajo condiciones de temperatura y tiempo de conservación antes de su procesamiento. Los puntos de tiempo incluyeron < 12 horas (muestra inicial), 24, 48, 72, 96 y 120 horas. Y a temperatura ambiente (20-25 °C) y refrigeración (4-8°). Resultados: variables como la temperatura y el tiempo influyen en los recuentos de las diferentes subpoblaciones linfocitarias; son más críticos los efectos de la temperatura ambiente sobre el recuento y demás variables, que el paso del tiempo. La expresión CD4 fue el marcador más estable; por cada día que se evalúo se redujo 0.08 cél/µl y no fue estadísticamente significativo (IC 95%: 0.10-0.01; p = 0.104). El marcador CD45, presentó mayor reducción en el recuento absoluto. Con el paso de los días, en promedio, disminuyeron 0.53 cél/µl, dato que fue estadísticamente significativo (IC 95%: -0.97-0.09; p = 0.016). Respecto a la viabilidad evaluada en los linfocitos totales, ésta permaneció alta a temperatura de 4-8 °C durante 96 horas, con una mediana de 72.7%.

 

Abstract

Introduction: quantification of T-lymphocyte subsets is routinely performed in patients with acquired immunodeficiency syndrome (HIV) by flow cytometry, in order to stage infection and response to antiretroviral therapy. Although some commercial houses suggest processing the samples in a period of 48 hours at 20-25 °C, there is no consensus about the conditions of time and temperature in which the T lymphocytes are not affected. Materials and methods: fifty whole blood samples with EDTA anticoagulant from the Medellin metropolitan area were evaluated. Each one was exposed under conditions of temperature and storage time before processing. Time points included < 12 hours (initial sample), 24, 48, 72, 96 and 120 hours. And at room temperature (20-25 °C) and refrigeration (4-8 °C). Results: variables such as temperature and time influence the counts of the different lymphocyte subpopulations; the effects of ambient temperature on the count and other variables are more critical than the passage of time. CD4 expression was the most stable marker; For each day that was evaluated, it was reduced by 0.08 cells/µl and it was not statistically significant (95% CI: 0.10-0.01; p = 0.104). The CD45 marker presented a greater reduction in the absolute count. Over the days, on average, 0.53 cells/µl decreased, a fact that was statistically significant (95% CI: -0.97-0.09; p = 0.016). Regarding the viability evaluated in total lymphocytes, it remained high at a temperature of 4-8 °C for 96 hours, with a median of 72.7%

 

Introducción

Los linfocitos Τ son un grupo heterogéneo de células específicas para el reconocimiento de antígenos(1). Dado su papel determinante en el establecimiento de las respuestas adaptativas de la respuesta inmune, su recuento es de gran importancia en enfermedades que se caracterizan por alteraciones en su número y frecuencia, como en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (VIH). Con la citometría de flujo (CMF) se estima el número de células CD4, parámetro crítico útil para estadificar la infección y guiar la toma de decisiones en cuanto a la conducta clínica a seguir(2). Uno de los puntos críticos de la fase preanalítica de la CMF es el tiempo que transcurre desde la toma de la muestra hasta su procesamiento y la temperatura a la que esté expuesta, debido a que las muestras se remiten a laboratorios de referencia desde otros lugares(3). La casa comercial recomienda realizar la tinción de las muestras en un plazo de 48 horas(4), mientras que otros proveedores aconsejan analizar las muestras a las 24 horas(5), autores como Glencross, et al.(6) indican que utilizar estrategias de análisis citométrico, como el “panleucogating”, facilita la medición precisa de CD4, incluso después de la pérdida de las propiedades de dispersión directa, hasta cinco días luego de flebotomía.

La pérdida de estabilidad se traduce en cambios de expresión de los marcadores, lo cual ocasiona alteraciones en los resultados que pueden conducir a imprecisiones o fallos en las decisiones clínicas(7). Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue evaluar la estabilidad de los linfocitos T CD45, CD3, CD4 y CD8 en diferentes condiciones de temperatura y tiempo.

 

Materiales y métodos

Población

Se evaluaron 50 muestras de sangre periférica con anticoagulante EDTA, provenientes del área metropolitana de Medellín durante el año 2021, que tenían solicitud para el recuento de linfocitos T CD3, CD8, CD45 y CD4, y cuyo tiempo de toma de muestra fuera menor a 12 horas. El procesamiento se desarrolló en el laboratorio Synlab SAS. Las 50 muestras correspondieron a 36 pacientes con diagnóstico previo de VIH (carga viral por PCR tiempo real) y 14 pacientes que no contaban con datos de carga viral en la institución. Cada muestra se evaluó en 6 momentos en el tiempo (< 12, 24, 48, 72, 96 y 120 horas) y en dos temperaturas (4-8 °C y 20-25 °C), para un total de 550 mediciones de linfocitos T, para esto se realizaron 10 alícuotas con 250 µl de sangre total con EDTA, en tubos plásticos Eppendorf de 1.5 ml.

Este proyecto cuenta con el aval de la institución, no hubo contacto directo con el participante, ni se tomó información sensible de su historia clínica, ni datos personales que puedan identificar al paciente, por lo tanto, se respetaron los principios de confidencialidad y la custodia de datos sensibles. Asimismo la institución, en el consentimiento informado que aplica a todo paciente que se realiza un examen, contempla lo establecido en la Ley Colombiana 1581 de 2012, sobre la protección de datos, por lo tanto, el compromiso con la institución fue de uso exclusivo para esta investigación científica que sólo implica un estudio de calidad de muestra y no incluye estudios genéticos, ni modificaciones a la muestra de otro uso.

 

Cuantificación de linfocitos T CD3, CD8, CD45 y CD4

Para la cuantificación de los linfocitos T CD3, CD8, CD45 y CD4 se realizó el siguiente procedimiento: se depositaron 50 µl en los tubos BD Truocunt. Luego se adicionaron 20 µl del reactivo BD multitest, que contiene anticuerpos monoclonales marcados con diferentes fluorocromos: anti-CD3 con FITC clon SK7, anti-CD8 marcado con PE clon SK1, anti-CD45 con PerCP clon 2D1 y CD4 marcado con APC clon SK3 y se analizó por el citómetro de flujo BD FACSLyric ™, utilizando el programa BD facs clinical.

 

Viabilidad de linfocitos T totales

Se utilizó un tubo de poliestireno, se dispensaron 50 μl de la muestra por pipeteo inverso y se adicionaron 5 μl de CD45 FITC y 5 μl del reactivo de viabilidad actinomicina D (7AAD), luego fue analizado en el citómetro BD FACSLyric ™, utilizando el programa BD facs suite.

Se realizó la evaluación de dos niveles de control CD check plus, el cual es un control de sangre completo, con análisis de valores (absolutos y relativos) de linfocitos T CD45, CD3, CD4 y CD8, disponible en dos niveles clínicamente relevantes de células CD4+(8). Además, el laboratorio cuenta con el control externo del Colegio Americano de Patólogos (CAP), que aprueba de manera satisfactoria.

 

Análisis estadístico

Todas las variables cuantitativas fueron expresadas con la mediana y el rango intercuartil, las diferencias en la mediana de los recuentos absolutos de CD45, CD4, CD8 y CD3 en el tiempo, fueron comparadas con la prueba de rango de Wilcoxon para muestras pareadas. Se analizó cada una de las temperaturas evaluadas (ambiente 20-25 °C y refrigeración 4-8 °C).

Por otro lado, y con el fin de comparar el efecto independiente de las variables de tiempo y temperatura en los desenlaces de interés (viabilidad de los linfocitos T totales, recuento de valores absolutos, e intensidad media de fluorescencia de los linfocitos T CD45, CD4, CD8 y CD3), se utilizó un modelo de ecuaciones de estimación generalizada (GEE, del inglés generalized estimating equations)

 

Resultados

De 50 muestras estudiadas, la mayoría correspondió a hombres (80%; n = 40), con una mediana de edad de 34 años (RIC: 26-39).

 

Viabilidad de linfocitos T totales

En la observación de la viabilidad de linfocitos totales con CD45 FITC y 7AAD se encontró que los resultados de las medianas son mayores a temperatura de refrigeración (Figura 1). Dicha viabilidad disminuye, en promedio, 0.51% por cada día que pasa según el modelo GEE (Tabla 2). Respecto a la temperatura, se evidenció mayor reducción a temperatura ambiente, con 22.24 % (IC 95%: -22.24 a -20.05; p < 0.001) (Tabla 1).

 

Figura 1. Medianas de la viabilidad de linfocitos a temperatura ambiente y de refrigeración.

 

Tabla 1. Modelo GEE con un intervalo de confianza del 95 % y valor de p de la mediana de viabilidad de linfocitos totales evaluados en un período de tiempo (basal, 24, 48, 72, 96 y 120 horas) a temperatura ambiente y de refrigeración

Variables

Coeficiente

ajustado

Intervalo de confianza 95%

Valor p

Tiempo

-0.51a

-0.54

-0.48

<0.001*

Temperatura

-22.24b

-24.44

-20.05

<0.001*

 a Coeficiente ajustado por la temperatura *valores de p estadísticamente significativo

 b Coeficiente ajustado por el tiempo.

 

Recuento absoluto de linfocitos totales

A temperatura ambiente (20-25 °C), la mediana de la medición basal (< 12 horas) del recuento absoluto de CD45 fue de 1727 cél/µl y disminuyó a medida que pasó el tiempo (Figura 2), con una mediana de 1564.5 cél/µl a las 120 horas y una pérdida de 9.4% de células (Tabla 2). Por su parte, a 4 °C se observó un ligero incremento del recuento a las 48 horas, con una mediana de 1840 cél/µl confrontado con la medición basal, que luego disminuyó a las 72 horas (Tabla 2). Los resultados obtenidos por el modelo GEE evidenciaron asociación estadísticamente significativa entre el tiempo y el recuento de linfocitos totales. De esta manera, por cada día que la muestra fue almacenada, hubo una reducción en promedio de 0.53 cél/µl (IC 95%: -0.97 a -0.09, p = 0.016) independiente de la temperatura. Además, el marcador CD45 presentó mayor reducción del recuento absoluto a temperatura ambiente, en comparación con los demás anticuerpos evaluados (Tabla 3).

 

Figura 2: Medianas del recuento absoluto de los linfocitos T CD45 (panel A), CD3 (panel B) CD4 (panel C) y CD8 (panel D), en relación con el tiempo (0, 24, 48, 72, 96 y 120 horas) a temperatura ambiente y refrigeración

 

 

Tabla 2. Prueba de rango de Wilcoxon para medianas del recuento de linfocitos T CD45, CD3, CD4 y CD8 en relación con el tiempo (basal, 24, 48, 72, 96 y 120 horas) y en cada una de las temperaturas evaluadas (4 °C y 25 °C)

Recuentos absolutos

Marcador

Tiempo (Horas n=50)

Mediana recuento absoluto ambiente (20-25 °C)

% de pérdida +

Mediana recuento absoluto refrigeración (4-8 °C)

% de pérdida+

Valor de p

 

CD45

0(n=50)

1727

 

 

 

 

 

24(n=50)

1638.5

5.2

1690

2.1

0.119

 

48(n=50)

1597

7.5

1840

6.5

0.004

 

72(n=50)

1598.5

7.4

1743.5

0.9

<0.001

 

96(n=50)

1545.5

10.4

1788

3.5

<0.001

 

120(n=50)

1564.5

9.4

1686

2.3

<0.001

 

CD3

0(n=50)

1196

 

 

 

 

 

24(n=50)

1207

0.91

1215.5

1.6

0.005

 

48(n=50)

1167.5

2.4

1301

8.7

<0.001

 

72(n=50)

1037

13.4

1230.5

2.8

<0.001

 

96(n=50)

1119.5

6.3

1277.5

6.8

<0.001

 

120(n=50)

1174.5

1.79

1153

3.5

<0.001

 

CD4

0(n=50)

242

 

 

 

 

 

24(n=50)

229

5.31

249.5

3.0

0.087

 

48(n=50)

235.5

2.6

255.5

5.5

<0.001

 

72(n=50)

225

7.0

245

1.2

<0.001

 

96(n=50)

246.5

1.8

246.5

1.8

<0.001

 

120(n=50)

218.5

9.7

227.5

5.9

0.013

 

CD8

0(n=50)

707

 

 

 

 

 

24(n=50)

677.5

4.1

668

5.5

0.007

 

48(n=50)

718

1.5

699.5

1.0

0.001

 

72(n=50)

622.5

11.9

757.5

7.1

<0.001

 

96(n=50)

641.5

9.2

760

7.4

<0.001

 

120(n=50)

654.5

7.4

715

1.1

<0.001

 

Valores de p resaltados en negrilla.

+ Porcentaje de pérdida; resultado de la diferencia del valor absoluto de cada marcador evaluado en el tiempo, comparado con la medición basal a temperatura ambiente.

 

Tabla 3. Modelo GEE con un intervalo de confianza del 95% y valor de p de la mediana del recuento absoluto de de linfocitos T CD45, CD3, CD4 y CD8 evaluados en un período de tiempo (basal, 24, 48, 72, 96 y 120 horas) a temperatura ambiente y de refrigeración

Variable

Coeficiente ajustado

Intervalo de confianza

Valor de p

Recuento absoluto CD45

Tiempo

-0.53

-0.97

-0.09

0.016

Temperatura

-123.55

-162.80

-162.80

<0.001

Recuento absoluto de CD3

Tiempo

-0.24

-0.58

0.09

0.163

Temperatura

-98.97

-131.19

-66.74

<0.001

Recuento absoluto de CD4

Tiempo

-0.08

-0.19

0.01

0.104

Temperatura

-25.90

-36.75

-15.05

<0.001

Recuento absoluto de CD8

Tiempo

-0.16

-0.41

0.08

0.186

Temperatura

-61.62

-84.10

-39.13

<0.001

Recuento relativo de CD3

Tiempo

0.010

0.005

0.016

<0.001

Temperatura

-0.33

-0.72

0.06

0.100

Recuento relativo de CD4

Tiempo

0.0008

-0.001

0.003

0.451

Temperatura

0.23

0.06

0.41

0.007

Recuento relativo de CD8

Tiempo

-0.09

-0.47

0.27

0.611

Temperatura

-21.06

-53.12

10.99

0.198

                                        a Coeficiente ajustado por la temperatura.

                                        b Coeficiente ajustado por el tiempo.

                        Valores de p estadísticamente significativos en negrilla

 

Efecto del tiempo y la temperatura en el recuento de linfocitos T CD3+

En general se observó reducción en el tiempo del recuento absoluto de linfocitos T CD3+ tanto a temperatura ambiente como de refrigeración (Figura 2). A temperatura ambiente mostró un ligero aumento en la expresión de la mediana de CD3 a las 24 horas (1207 cél/ µl), respecto a la medición inicial (1196 cél/µl) (Tabla 3). Luego disminuyó en los tiempos subsecuentes, en comparación con la temperatura de 4 °C, en cuyo caso dicho incremento fue hasta las 48 horas (1301 cél/µl) (Tabla 3). En cuanto al modelo GEE, se observó que por cada día que pasó, en promedio disminuyeron 0.24 cél/µl, cifra que no es estadísticamente significativa (IC 95%: -0.58 a 0.09; p = 0.163) (Tabla 4), mientras que cuando las muestras se almacenaron a temperatura ambiente se redujo a 98.9 cél/µl (Tabla 4).

 

Efecto del tiempo y la temperatura en el recuento de linfocitos T CD4+

La mediana del recuento absoluto para CD4+ fue similar en refrigeración y temperatura ambiente, con un ligero incremento a las 48 horas en ambas temperaturas (Figura 2). También se observó una menor influencia del tiempo respecto al recuento absoluto. Por cada día que se evalúo se redujo 0.08 cél/µl (IC 95%: -0.19-0.01; p = 0.104) no fue estadísticamente significativo (Tabla 4). En cuanto a la temperatura, se apreció una reducción menor en comparación con los demás anticuerpos evaluados de 25.9 cél/µl bajo temperatura de 20 a 25 °C (Tabla 4). Así mismo, el resultado de la mediana del porcentaje para CD4+ fue idéntico tanto a temperatura ambiente, como de refrigeración. Cabe resaltar que el marcador antes mencionado presentó menor reducción del recuento respecto al tiempo y a la temperatura, en comparación con los demás anticuerpos evaluados.

 

Efecto del tiempo y la temperatura en el recuento linfocitos T CD8+

La mediana del recuento absoluto de CD8 presentó una detección mayor en las muestras almacenadas a 4 °C a partir de las 72 horas (757.5 cél/µl) (Tabla 3) hasta las 120 horas, en comparación con la temperatura ambiente (figura 2), que mostró una disminución a las 72 horas (mediana 622.5 cél/µl) (Tabla 3). En el análisis multivariado se evidenció una mayor reducción en la expresión del marcador a temperatura ambiente que a temperatura de refrigeración, con un coeficiente ajustado de 61.6 cél/µl (IC 95%: -84.10 a -39.13; p < 0.001). Con el paso de los días se observó un descenso que corresponde a 0.16 cél/µl y no fue estadísticamente significativo (IC 95%: -0.41- 0.08; p = 0.186) (Tabla 3).

 

Evaluación de intensidad media de fluorescencia (MFI)

El resultado de las medianas a temperatura ambiente y de refrigeración es similar. Se observó que, en cuanto a las MFI para los marcadores CD45, CD3, CD4 y CD8, el anticuerpo CD8 presentó mayor pérdida de fluorescencia con el paso del tiempo y cuando fue almacenado a temperatura ambiente, en tanto que el marcador CD3 tuvo menor reducción de la fluorescencia en el tiempo; sin embargo, cuando ambos fueron almacenados a 4 °C conservaron la MFI, en comparación con los anticuerpos CD45 y CD4 (Tabla 4)

 

Tabla 4. Modelo GEE con un intervalo de confianza del 95 % y valor de p de la mediana de intensidad de fluorescencia (MFI) de linfocitos T CD45, CD3, CD4 y CD8 evaluados en un periodo de tiempo (basal, 24, 48, 72, 96 y 120 horas) a temperatura ambiente y de refrigeración.

Variables

Coeficiente ajustado

Intervalo de

confianza

Valor de p

 

Intensidad media de fluorescencia (MFI) de CD45

Tiempo

a-13.61

-14.84

-12.39

< 0.001

Temperatura

b-487.05

-487.05

-397.62

< 0.001

 

Intensidad media de fluorescencia (MFI) de CD3

Tiempo

a-4.66

-5.41

-3.91

< 0.001

Temperatura

b-58.82

-114.56

-3.09

0.039

 

Intensidad media de fluorescencia (MFI) de CD4

Tiempo

a-30.16

-34.86

-25.45

< 0.001

Temperatura

b575.48

226.96

924.00

0.001

 

Intensidad media de fluorescencia (MFI) de CD8

Tiempo

a-114.47

-125.40

-103.55

< 0.001

Temperatura

b-3640.09

-4421.96

-2858.23

< 0.001

                                        a Coeficiente ajustado por la temperatura.

                                        b Coeficiente ajustado por el tiempo.

                        Valores de p estadísticamente significativos en negrilla

 

Discusión

La calidad de la muestra es un parámetro importante cuando se realiza una evaluación por citometría de flujo. Se requiere de una muestra de alta calidad para evitar las tinciones no específicas de los marcadores(7). Sin embargo, en la actualidad son pocos los estudios que evalúan la estabilidad de las muestras para cuantificación de linfocitos T y la mayoría no son recientes. En esta investigación la viabilidad de los linfocitos totales permaneció alta a temperatura de 4-8 °C durante 96 horas, con una mediana de 72.7% en comparación al estudio de Ekong et al.(9), en el que encontraron que para las muestras VIH+ almacenadas a 4 °C las viabilidades de los subconjuntos permanecieron altas (> 92%); asimismo, cuando éstas se almacenaron a 21 °C hubo una pérdida significativa de células viables en los tres subconjuntos, la cual fue mayor en los CD8+ y menor en los CD3+ yCD4+. Por tanto, se propone que la variación en el porcentaje de la viabilidad entre ambos estudios, puede atribuirse a la metodología y al reactivo de viabilidad utilizado, yoduro de propidio (PI) vs. aminoactinomicina D; ésta última no es tan brillante como el PI(10).

Los resultados muestran cómo la temperatura y el tiempo influyen en los recuentos de las diferentes subpoblaciones linfocitarias, siendo más crítica la temperatura. En el caso de las expresiones CD45, CD3, CD4 y CD8 se observó que la mediana del recuento absoluto fue mayor en las muestras que se almacenaron a 4 °C. Sin embargo, en otro estudio publicado por Ekong et al.(11) se evidenció un aumento sólo en el recuento de los linfocitos T CD8+, hecho que puede atribuirse a las modificaciones en la membrana celular durante el almacenamiento a 4 °C y traducirse en una mayor o menor exposición de los antígenos de superficie cuya disponibilidad para reaccionar con el anticuerpo monoclonal se vería afectada(12).

En el presente estudio se encontró una reducción de la mediana del valor absoluto de las diferentes subpoblaciones linfocitarias con el paso del tiempo a temperatura ambiente, que, en el caso del recuento de la población CD4+, bajó 9.7% a las 120 horas, respecto al recuento basal, similar al recuento CD8+, que bajó 7.4% a las 120 horas en comparación con la medición inicial. Sin embargo, los cambios encontrados en el recuento de CD4+ se pueden atribuir a la variabilidad biológica intraindividual que en la literatura se reporta en un 25%(13). Además, los resultados no causarían implicaciones clínicas para los pacientes, ya que no superan el 30% del conteo absoluto o un incremento o decrecimiento en el porcentaje de células CD4 en 3 puntos o más(14).

Entre los estudios que tenían similitud en la metodología de la prueba y en sus resultados con esta investigación está el propuesto por Olteanu(15) en el que, utilizando protocolos de activación de ventanas (gate) específicos de linaje que aprovechan la propiedad de los linfocitos mantienen una expresión uniforme y de alta densidad de CD45, que permiten seleccionar de manera apropiada las poblaciones, demostraron valores de células T que se mantienen hasta las 72 horas a 4 °C y hasta las 96 horas a 21 °C. Las diferencias podrían atribuirse a la evaluación en ese rango de tiempo pues a temperatura de refrigeración sólo evaluaron hasta 72 horas. En la investigación realizada por Okomo(16) se encontraron recuentos de CD4 reproducibles hasta las 72 horas a temperatura ambiente, a diferencia de los resultados obtenidos en el presente estudio, demostraron que dichas variables como el tiempo y la temperatura tienen un impacto en las diferentes subpoblaciones linfocitarias. Como se pudo demostrar con el paso de los días, hubo una disminución en las subpoblaciones linfocitarias, pese a lo cual la temperatura de 4-8 °C favoreció tanto la estabilidad, como el recuento absoluto y relativo de las mismas. Estos resultados sugieren que la cuantificación de linfocitos T puede hacerse en muestras almacenadas a temperatura de refrigeración hasta 4 días después de la recolección, sin comprometer los resultados.

 

Bibliografía

1.        Barrero S, Cuéllar A, Rueda N y col. Determinación de valores de linfocitos T CD3+/CD3+/CD4+ y CD3+/CD8+ por citometría de flujo en adultos donantes de sangre del Hospital Universitario San Ignacio de Bogotá. Acta Méd Colomb. 2001;26:280-5.

2.        Carbajal-Martel BH, Bu-Figueroa E, Sierra-Santos M. Prevalencia de infecciones oportunistas en pacientes VIH positivo asociados al conteo disminuido de células linfocitos CD4+. Hospital Escuela, 2001. Rev Me Post XJNAH. 2002;7.

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4.        BD Biosciences. BD Multitest™ CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP / CD4 APC reagent. Disponible en: https://www.bdbiosciences.com/en-nz/products/reagents/flow-cytometry-reagents/clinical-diagnostics/multicolor-cocktails-and-kits-ivd-ce-ivds/bd-multitest-cd3-fitc-cd8-pe-cd45-percp-cd4-apc-reagent.340499.

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